Prueba de CAMP positiva para Listeria monocytogenes. Fuente: Benadof, Dona. (2008). Listeria monocytogenes. Revista chilena de infectología, 25(5), 350. https://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182008000500005

FUNDAMENTOS

Para esta prueba se utilizan cepas de Staphylococcus aureus y Rhodococcus equi productoras de betalisina. Algunas especies de Listeria producen una proteína extracelular (factor CAMP), la cual actúa sobre los eritrocitos en forma sinérgica con la betalisina. Se pueden emplear placas de agar sangre ovina, pero es preferible usar el método de la doble capa.

MEDIO PARA CAPA BASAL *

Ingredientes

Agar base sangre Nº 2 ...........................................240 g
Agua destilada...................................................... 1000 ml

Preparación del medio

Disolver la base deshidratada en agua destilada mediante ebullición. Ajustar pH a 7. Transferir a tubos o frascos. Esterilizar durante 15 minutos a 121 ºC. Enfriar a 45 ºC

MEDIO SANGRE OVINA **

Ingredientes

Medio basal ..............................................................100 ml
Sangre ovina desfibrinada estéril .......................7 ml

Preparación del medio

Agregar sangre ovina al medio base estéril y fundido.

MEDIO COMPLETO

Preparación del medio

Distribuir 10 ml de medio basal* en placa para forma una capa. Dejar solidificar. Agregar 3 ml del medio sangre ovina**, para formar capa muy fina.
Advertencia: Si el medio con sangre se agrega a placas de medio basal preparadas anteriormente, es necesario colocarlas previamente en estufa a 36 ºC durante 20 minutos antes de agregar la capa fina con sangre.

Cultivos patrones

Staphylococcus aureus NCTC 1803 Rhodococcus equi NCTC 1621

Mantenimiento: Cultivar en estrías, incubar a 36 ºC. Subcultivar cada treinta días.

REALIZACIÓN DE LA PRUEBA

Trazar una línea de Staphylococcus aureus a lo largo de la placa y otra paralela y alejada de Rhodococcus equi, en forma de inóculo fino. De igual manera sembrar perpendicularmente a las cepas patrones los cultivos incógnita que se desean probar, sin tocar la línea del S. aureus ni al R. equi, pero a distancia aproximada de 5 mm.
Pueden probarse simultáneamente varias cepas en la misma placa. Si se emplea el método de doble capa, incubar a 36 ºC durante 12-18 horas. Si se hiciera la prueba en monocapa de agar sangre, incubar a igual temperatura durante 24 horas.

LECTURA E INTERPRETACIÓN

Reacción positiva con S. aureus: zona de beta-hemólisis estimulada en la intersección de la cepa incógnita. Se observa como una pequeña zona redondeada de hemólisis. Si se observa una zona pequeña con R. equi, se considera negativa.
Reacción positiva con R. equi: zona ancha en forma de cabeza de flecha.

Modelo de inoculación en placa de agar sangre de carnero:
Las líneas horizontales representan las estrías de S. aureus (S) y R. equi (R).
Las líneas verticales representan las estrías de los aislamientos que posiblemente son Listeria.
Las líneas intersectadas indican las regiones de aumento de la hemólisis.

CONTROL DE LA CALIDAD

Control positivo: Listeria monocytogenes ATCC 19111; ATCC 13932
Control negativo: Listeria innocua ATCC 33090

Fuente: Servicio Bacteriología Especial Departamento de Bacteriología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán” (2008). Manual de Procedimientos Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria monocytogenes. Buenos Aires: Callejo, R. , Prieto, M. , Martínez, C. , Aguerre, L. , Rocca, F. y Martínez G.

FUNDAMENTOS DE LA PRUEBA

Se detecta la presencia de la enzima catalasa utilizando como sustrato peróxido de hidrógeno al 3%. Esta prueba puede ser realizada en portaobjeto o en tubo. No partir de cultivos en medios con sangre, ya que, la enzima catalasa está presente en los eritrocitos y cualquier arrastre del medio puede resultar en falsos positivos.

REALIZACIÓN DE LA PRUEBA

Tomar colonia de cultivo de 18-24 horas y depositarla sobre un porta. Añadir con pipeta una gota de peróxido de hidrógeno al 3%; no homogeneizar el cultivo con el ansa para evitar los falso positivos.

LECTURA E INTERPRETACIÓN

Se considera positiva cuando se observan burbujas de gas (02). Las especies de Listeria son catalasa positiva, evidenciada por formación de burbujas de gas.

CONTROL DE CALIDAD

Control positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923
Control negativo: Enterococcus faecalis ATCC 29212

Fuente: Servicio Bacteriología Especial Departamento de Bacteriología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán” (2008). Manual de Procedimientos Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria monocytogenes. Buenos Aires: Callejo, R. , Prieto, M. , Martínez, C. , Aguerre, L. , Rocca, F. y Martínez G.