Microscopía de la muestra
Materiales. Equipamiento
- Ansa
- Cabina de bioseguridad
- Incinerador de ansas
- Microscopio con lente de inmersión 100X de magnificación
- Portaobjeto de vidrio
Nota: el uso de cabina de bioseguridad evitará la contaminación del cultivo o muestra, así como protegerá al operador
Reactivos
- Aceite de inmersión
- Equipo de colorantes para Gram
Procedimiento
| Día 1 | Comentarios |
| • Colocar 5 a 6 gotas de la muestra en un portaobjeto y extender • Dejar secar dentro de la cabina de bioseguridad • Colorear con la técnica de Gram, observar e interpretar • La observación de cualquier número de cocobacilos Gram positivos debe ser informado inmediatamente al médico tratante |
El número de L. monocytogenes en el LCR puede ser menor a 103 UFC/ml, por lo tanto la concentración por centrifugación para la coloración de Gram es importante para el diagnóstico rápido |
Aislamiento e identificación
Materiales. Equipamiento
- Ansa
- Cabina de bioseguridad
- Incinerador de ansas
- Estufa de cultivo 35 – 37 ºC con atmósfera de 5% de CO2
Medios de cultivo
- Agar tripteína soya
- Agar tripteína soya con 5% sangre ovina
- Caldo nutritivo
Procedimiento
| Día 1 | Comentarios |
| • Centrifugar la muestra para concentrar • Aspirar el fluido desde el fondo del tubo utilizando una pipeta estéril y colocar 2 ó 3 gotas en una placa de agar tripticasa soja con sangre ovina al 5% y en una placa de agar tripticasa soya sin sangre. Sembrar en técnica de aislamiento en cuatro cuadrantes • Inocular también en caldo tioglicolato o caldo nutritivo. Incubar placas a 35 - 37 ºC en atmósfera de 5% de CO2 por 24 - 48 horas. Incubar caldos a 35 – 37 ºC en atmósfera normal |
El número de L. monocytogenes en el LCR puede ser menor a 103 UFC/ml, por lo tanto la concentración por centrifugación mejora la recuperación por cultivo |
| Día 2 | Comentarios |
| • Examinar las placas y caldos a las 24 horas para detectar evidencia macroscópica de desarrollo bacteriano. En caso negativo, reincubar • Realizar coloración de Gram y prueba de catalasa de colonias sospechosas en placa de agar tripteína soya • Subcultivar en estría de agar tripteína soya |
Colonias sospechosas: pequeñas convexas, transparentes-grisáceas con beta hemólisis difusa La observación microscópica de bacilos pequeños o cocobacilos gram positivos, la presencia de colonias pequeñas con beta hemólisis difusa y catalasa positiva representa una fuerte sospecha de L. monocytogenes que debería ser informada al médico tratante en forma inmediata |
| Día 3 | Comentarios |
| • A partir del subcultivo en estría proseguir la identificación confirmatoria | En caso de microscópica positiva a partir del Gram directo de la muestra con cultivos negativos a las 24 horas, reincubar las placas y caldos por al menos una semana y observar diariamente |
Fuente: Servicio Bacteriología Especial Departamento de Bacteriología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán” (2008). Manual de Procedimientos Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria monocytogenes. Buenos Aires: Callejo, R. , Prieto, M. , Martínez, C. , Aguerre, L. , Rocca, F. y Martínez G.
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