Aislamiento e identificación
Materiales. Equipamiento
• Ansa
• Cabina de bioseguridad
• Incinerador de ansas
• Estufa de cultivo 35 – 37 ºC
• Microscopio con lente de inmersión 100X de magnificación
• Portaobjeto de vidrio
Consideraciones de bioseguridad
• Consideraciones generales para patógenos clase II.
• Utilizar cabina de bioseguridad para prácticas microbiológicas con potencial formación de aerosoles.
• Utilizar siempre guantes
• La presencia de mujeres embarazadas e individuos potencialmente inmunodeprimidos debe estar
absolutamente prohibida en áreas donde se manipule Listeria monocytogenes
Reactivos y Medios de cultivo
• Aceite de inmersión
• Agar tripteína soya
• Agar tripteína soya con 5% sangre ovina
• Caldo Fraser
• Caldo nutritivo
• Medios selectivos (agar Oxford modificado MOX)
• Equipo para coloración de Gram
• Peróxido de hidrógeno al 3%
Procedimiento
| Día 1 | Comentarios |
| • Colocar 1 g o 1 ml de materia fecal en 10 ml de caldo UVM • Incubar 24 horas a 30 ºC |
|
| Día 2 | Comentarios |
| • Sembrar 0.1 ml de UVM en medio selectivo agar MOX • Sembrar 0.1 ml de UVM en 10 ml de caldo Fraser • Incubar a 30 ºC por 24 horas |
|
| Día 3 | Comentarios |
| • Observar presencia de colonias sospechosas en el agar Oxford y subcultivar hasta 5 colonias en medio sólido (agar sangre, agar tripticasa soya), y medio líquido (caldo nutritivo). Incubar medios sólidos a 35 ºC por 18-24 horas y medio líquido a 22 ºC • Sembrar 0.1 ml de caldo Fraser en agar MOX e incubar a 30ºC por 24 horas |
A las 24 horas las colonias típicas de L. monocytogenes en agar MOX, son pequeñas, rodeadas de halo de ennegrecimiento debido a la hidrólisis de esculina |
| Día 4 | Comentarios |
| • Observar beta hemólisis, realizar prueba de catalasa coloración de gram y observar movilidad en fresco • Si el desarrollo de colonias sospechosas en agar selectivo es negativo a las 24 horas, observar nuevamente y en el caso de aparición de colonias proseguir como descripto en día 3 |
La observación de bacilos o cocobacilos gram positivos, móviles, beta hemolíticos, catalasa positiva, indica sospecha de Listeria monocytogenes. Confirmar identificación con pruebas |
- Visto: 1200