Los microorganismos aislados convencionalmente y confirmados por caracterización bioquímica como Listeria monocytogenes, pueden ser serotipificados utilizando antisueros.
Cuando un antisuero específico es agregado a una suspensión celular, ocurre una reacción antígeno-anticuerpo produciendo una reacción positiva posible de ver a ojo desnudo.
Procedimiento
Método de aglutinación en portaobjeto para la determinación del antígeno de superficie polivalente (O)
- Sembrar una placa de agar infusión cerebro corazón, incubar 18-24 horas
- Preparar suspensión celular en cloruro de sodio 0.2% a partir de la placa con una concentración final de 10 mg/ml
- Calentar la suspensión a 121º C durante 30 minutos
- Centrifugar a 3.000 r.p.m. durante 20 minutos
- Volcar el sobrenadante y resuspender el precipitado con pequeñas cantidades de cloruro de sodio 0.2%
Prueba de aglutinación
- En un portaobjeto limpio marcar los bordes con marcador para vidrio para evitar el corrimiento del líquido. Pueden utilizarse vidrios de mayor superficie para más de una aglutinación procediendo de la misma forma que con el portaobjetos.
- Colocar una gota de antisuero OI/II, una del OV/VI y una gota de solución fisiológica.
- Colocar una ansada de la suspensión celular cerca de cada gota de antisuero y solución fisiológica.
- Homogeneizar bien la suspensión.
- Colocar el portaobjeto o vidrio sobre un fondo oscuro y observar los patrones de aglutinación a ojo desnudo.
- Considerar una aglutinación positiva fuerte cuando aparezca dentro del minuto de realizada la mezcla. Se debe determinar si ocurre o no autoaglutinación entre la solución fisiológica y la suspensión celular.
Prueba de aglutinación en porta objetos utilizando antisueros individuales
- Cuando los aislamientos de L. monocytogenes producen aglutinación positiva con los antisueros polivalentes se debe continuar con los antisueros individuales
Aglutinación positiva para antisuero OI/II
- Para continuar con la serotipificación utilizar antisueros OI y OIV y proceder de igual forma que con los antisueros polivalentes
Aglutinación positiva para antisuero OV/VI
- Para continuar con la serotipificación utilizar antisueros OVI, OVII, OVIII y OIX y proceder de igual forma que con los antisueros polivalentes.
Método en tubo para la determinación del antígeno somático (H)
- Como L. monocytogenes posee solamente de 1 a 4 flagelos, se recomienda aumentar la movilidad, realizando tres pasajes del cultivo en medio infusión cerebro corazón semisólido con tubos de Craigie´s, partiendo de un cultivo fresco en medio líquido infusión cerebro corazón.
- La suspensión celular utilizada para la determinación se prepara en medio infusión cerebro corazón incubado a 30º C durante toda la noche, agregando cantidades iguales de suspensión celular y solución fisiológica con formalina al 1% v/v
- Colocar dos gotas de cada antisuero somático en diferentes tubos y agregar 0.5 ml de la suspensión celular en cada uno.
- Agitar los tubos e incubar en baño termostatizado (50 - 52º C), durante una hora.
- Observa si ocurre o no aglutinación. Evitar agitar los tubos durante la observación, ya que la aglutinación puede romperse fácilmente
- Considerar una aglutinación visible a ojo desnudo como positiva.
Determinación de serotipos
El serotipo de los aislamientos de L. monocytogenes será determinado de acuerdo a la siguiente tabla
| Serotipo | Antígeno O | Antígeno H |
| 1/2 a | I, II, (III) | AB |
| 1/2 b | I, II, (III) | ABC |
| 1/2 c | I, II, (III) | BD |
| 3 a | II, (III), IV | AB |
| 3 b | II, (III), IV, (XII), (XIII) | ABC |
| 3 c | II, (III), IV, (XII), (XIII) | BD |
| 4 a | (III), (V), VII, IX | ABC |
| 4 ab | (III), V, VI, VII, IX, X | ABC |
| 4 b | (III), V, VI | ABC |
| 4 c | (III), V, VII | ABC |
| 4 d | (III), (V), VI, VIII | ABC |
| 4 e | (III), V, VI, (VIII), (IX) | ABC |
| 7 | (III), XII, XIII | ABC |
Precauciones
- Todos los cultivos e instrumentos tales como vidrios o tubos utilizados en estas pruebas deben ser esterilizados con una solución de hipoclorito de sodio al 0,1% por más de una hora o autoclavados a 121º C durante 20 minutos.
- Estas pruebas de serotipificación deben ser utilizadas solamente para cepas de L. monocytogenes aisladas de alimentos.
- No colocar los antisueros en el freezer, esto puede producir precipitaciones.
- Estos reactivos contienen 0.08% de azida de sodio como conservante.
Fuente: Servicio Bacteriología Especial Departamento de Bacteriología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán” (2008). Manual de Procedimientos Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria monocytogenes. Buenos Aires: Callejo, R. , Prieto, M. , Martínez, C. , Aguerre, L. , Rocca, F. y Martínez G.
