Materiales de sitios normalmente estériles:

Además de sangre y líquido cefalorraquídeo; líquido articular, liquido amniótico, líquido pericárdico, líquido pleural, placenta y tejido fetal.

La siembra se realiza en los medios indicados en el procedimiento descripto para líquido cefalorraquídeo.

Materiales de sitios no estériles:

Se deberá incluir un paso de enriquecimiento en caldo nutritivo incubado en frío (4 ºC) y/o siembra en caldos y medios selectivos según el procedimiento descripto para materia fecal.

Fuente: Servicio Bacteriología Especial Departamento de Bacteriología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán” (2008). Manual de Procedimientos Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria monocytogenes. Buenos Aires: Callejo, R. , Prieto, M. , Martínez, C. , Aguerre, L. , Rocca, F. y Martínez G.

Suspender 1g o 1 ml de materia fecal en 10 ml de Caldo UVM
               Incubar 48 horas a 30 ºC

      ╔═════════╩═════════╗

    MOX                                            Fraser

      ║                                                   ║

Incubar 24 horas a 30 ºC     Incubar 24 horas a 30 ºC

     ║                                                    ║

     ║                                        Sembrar en MOX

     ║                                                    ║

     ║                                       Incubar 24 horas a 30 ºC

     ║                                                    ║

                Colonias sospechosas

                                 ║

                        Agar sangre
                        Agar tripteína soya
                        Caldo nutritivo

                                 ║

                        Colonia sospechosa
                        β-hemólisis +
                        cocobacilo Gram +
                        catalasa +

                                 ║

                       Pruebas bioquímicas confirmatorias

                                 ║

                       Serotipificación

Procedimiento para la obtención de muestra materia fecal para Listeria monocytogenes

Procesamiento de materia fecal en el laboratorio para Listeria monocytogenes

Fuente: Servicio Bacteriología Especial Departamento de Bacteriología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán” (2008). Manual de Procedimientos Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria monocytogenes. Buenos Aires: Callejo, R. , Prieto, M. , Martínez, C. , Aguerre, L. , Rocca, F. y Martínez G.

Recolección y transporte de muestra

Materiales
• Frasco estéril tapa rosca para coprocultivo

Muestra
• El estudio de L. monocytogenes en materia fecal puede ser requerido en caso de cuadros de gastroenteritis febril asociado al consumo de alimentos contaminados o estudios de portación en investigaciones epidemiológicos.
• La muestra debe obtenerse en el período agudo de la enfermedad, antes de iniciar el tratamiento con antimicrobianos. Se recoge una muestra de una evacuación espontánea reciente, en frasco estéril. En caso de no poderse obtener la muestra, se realiza una hisopado rectal. Para los estudios epidemiológicos de portación fecal, las muestras de heces son más productivas que los hisopados rectales.

Transporte y recepción
• Remitir al laboratorio refrigerada en forma urgente y alertar que la muestra está en tránsito
• Rotular muestra con información demográfica, fecha, hora y sitio de recolección (punción lumbar, derivación ventricular)
• Procesar la muestra en forma inmediata
• La muestra debe ser procesada inmediatamente se puede mantener a 4 ºC por 48 horas.
• Para muestras que requieran mayor tiempo de almacenamiento, congelar a –20 ºC y enviar al laboratorio acondicionada con hielo seco

Fuente: Servicio Bacteriología Especial Departamento de Bacteriología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán” (2008). Manual de Procedimientos Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria monocytogenes. Buenos Aires: Callejo, R. , Prieto, M. , Martínez, C. , Aguerre, L. , Rocca, F. y Martínez G.

Aislamiento e identificación

Materiales. Equipamiento
• Ansa
• Cabina de bioseguridad
• Incinerador de ansas
• Estufa de cultivo 35 – 37 ºC
• Microscopio con lente de inmersión 100X de magnificación
• Portaobjeto de vidrio

Consideraciones de bioseguridad
• Consideraciones generales para patógenos clase II.
• Utilizar cabina de bioseguridad para prácticas microbiológicas con potencial formación de aerosoles.
• Utilizar siempre guantes
• La presencia de mujeres embarazadas e individuos potencialmente inmunodeprimidos debe estar
absolutamente prohibida en áreas donde se manipule Listeria monocytogenes

Reactivos y Medios de cultivo
• Aceite de inmersión
• Agar tripteína soya
• Agar tripteína soya con 5% sangre ovina
• Caldo Fraser
• Caldo nutritivo
• Medios selectivos (agar Oxford modificado MOX)
• Equipo para coloración de Gram
• Peróxido de hidrógeno al 3%

Procedimiento

Día 1 Comentarios
• Colocar 1 g o 1 ml de materia fecal en 10 ml de caldo UVM
• Incubar 24 horas a 30 ºC 
 
Día 2 Comentarios
 • Sembrar 0.1 ml de UVM en medio selectivo agar MOX
• Sembrar 0.1 ml de UVM en 10 ml de caldo Fraser
• Incubar a 30 ºC por 24 horas
 
Día 3 Comentarios
 • Observar presencia de colonias sospechosas en el agar Oxford y subcultivar hasta 5 colonias en medio sólido (agar sangre, agar tripticasa soya), y medio líquido (caldo nutritivo). Incubar medios sólidos a 35 ºC por 18-24 horas y medio líquido a 22 ºC
• Sembrar 0.1 ml de caldo Fraser en agar MOX e incubar a 30ºC por 24 horas
A las 24 horas las colonias típicas de
L. monocytogenes en agar MOX, son pequeñas, rodeadas de halo de ennegrecimiento debido a la hidrólisis de esculina 
Día 4  Comentarios
 • Observar beta hemólisis, realizar prueba de catalasa coloración de gram y observar movilidad en fresco
• Si el desarrollo de colonias sospechosas en agar selectivo es negativo a las 24 horas, observar nuevamente y en el caso de aparición de colonias proseguir como descripto en día 3
La observación de bacilos o cocobacilos gram positivos, móviles, beta hemolíticos, catalasa positiva, indica sospecha de Listeria monocytogenes.
Confirmar identificación con pruebas

Microscopía de la muestra

Materiales. Equipamiento

  • Ansa
  • Cabina de bioseguridad
  • Incinerador de ansas
  • Microscopio con lente de inmersión 100X de magnificación
  • Portaobjeto de vidrio

Nota: el uso de cabina de bioseguridad evitará la contaminación del cultivo o muestra, así como protegerá al operador

Reactivos

  • Aceite de inmersión
  • Equipo de colorantes para Gram

Procedimiento

Día 1 Comentarios
• Colocar 5 a 6 gotas de la muestra en un portaobjeto y extender
• Dejar secar dentro de la cabina de bioseguridad
• Colorear con la técnica de Gram, observar e interpretar
• La observación de cualquier número de cocobacilos Gram positivos debe ser informado inmediatamente al médico tratante
El número de L. monocytogenes en el LCR puede ser menor a 103 UFC/ml, por lo tanto la concentración por centrifugación para la coloración de Gram es importante para el diagnóstico rápido

 

Aislamiento e identificación

Materiales. Equipamiento

  • Ansa
  • Cabina de bioseguridad
  • Incinerador de ansas
  • Estufa de cultivo 35 – 37 ºC con atmósfera de 5% de CO2

Medios de cultivo

  • Agar tripteína soya
  • Agar tripteína soya con 5% sangre ovina
  • Caldo nutritivo

Procedimiento

Día 1 Comentarios
• Centrifugar la muestra para concentrar
• Aspirar el fluido desde el fondo del tubo utilizando una pipeta estéril y colocar 2 ó 3 gotas en una placa de agar tripticasa soja con sangre ovina al 5% y en una placa de agar tripticasa soya sin sangre. Sembrar en técnica de aislamiento en cuatro cuadrantes
• Inocular también en caldo tioglicolato o caldo nutritivo. Incubar placas a 35 - 37 ºC en atmósfera de 5% de CO2 por 24 - 48 horas.
Incubar caldos a 35 – 37 ºC en atmósfera normal
El número de L. monocytogenes en el LCR
puede ser menor a 103 UFC/ml, por lo tanto la concentración por centrifugación mejora la recuperación por cultivo
Día 2 Comentarios
• Examinar las placas y caldos a las 24 horas para detectar evidencia macroscópica de desarrollo bacteriano. En caso negativo, reincubar
• Realizar coloración de Gram y prueba de catalasa de colonias sospechosas en placa de agar tripteína soya
• Subcultivar en estría de agar tripteína soya
Colonias sospechosas: pequeñas convexas,
transparentes-grisáceas con beta hemólisis difusa
La observación microscópica de bacilos pequeños o cocobacilos gram positivos, la presencia de colonias pequeñas con beta hemólisis difusa y catalasa positiva representa una fuerte sospecha de L. monocytogenes que debería ser informada al médico tratante en forma inmediata
Día 3 Comentarios
• A partir del subcultivo en estría proseguir la identificación confirmatoria En caso de microscópica positiva a partir del Gram directo de la muestra con cultivos negativos a las 24 horas, reincubar las placas y caldos por al menos una semana y observar diariamente

 

Fuente: Servicio Bacteriología Especial Departamento de Bacteriología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán” (2008). Manual de Procedimientos Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria monocytogenes. Buenos Aires: Callejo, R. , Prieto, M. , Martínez, C. , Aguerre, L. , Rocca, F. y Martínez G.

Pruebas

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