Materiales de sitios normalmente estériles:
Además de sangre y líquido cefalorraquídeo; líquido articular, liquido amniótico, líquido pericárdico, líquido pleural, placenta y tejido fetal.
La siembra se realiza en los medios indicados en el procedimiento descripto para líquido cefalorraquídeo.
Materiales de sitios no estériles:
Se deberá incluir un paso de enriquecimiento en caldo nutritivo incubado en frío (4 ºC) y/o siembra en caldos y medios selectivos según el procedimiento descripto para materia fecal.
Fuente: Servicio Bacteriología Especial Departamento de Bacteriología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán” (2008). Manual de Procedimientos Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria monocytogenes. Buenos Aires: Callejo, R. , Prieto, M. , Martínez, C. , Aguerre, L. , Rocca, F. y Martínez G.
listeria monocytogenes, otros materiales
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Suspender 1g o 1 ml de materia fecal en 10 ml de Caldo UVM
Incubar 48 horas a 30 ºC
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MOX Fraser
║ ║
Incubar 24 horas a 30 ºC Incubar 24 horas a 30 ºC
║ ║
║ Sembrar en MOX
║ ║
║ Incubar 24 horas a 30 ºC
║ ║
Colonias sospechosas
║
Agar sangre
Agar tripteína soya
Caldo nutritivo
║
Colonia sospechosa
β-hemólisis +
cocobacilo Gram +
catalasa +
║
Pruebas bioquímicas confirmatorias
║
Serotipificación
Procedimiento para la obtención de muestra materia fecal para Listeria monocytogenes
Procesamiento de materia fecal en el laboratorio para Listeria monocytogenes
Fuente: Servicio Bacteriología Especial Departamento de Bacteriología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán” (2008). Manual de Procedimientos Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria monocytogenes. Buenos Aires: Callejo, R. , Prieto, M. , Martínez, C. , Aguerre, L. , Rocca, F. y Martínez G.
listeria monocytogenes, materia fecal
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Recolección y transporte de muestra
Materiales
• Frasco estéril tapa rosca para coprocultivo
Muestra
• El estudio de L. monocytogenes en materia fecal puede ser requerido en caso de cuadros de gastroenteritis febril asociado al consumo de alimentos contaminados o estudios de portación en investigaciones epidemiológicos.
• La muestra debe obtenerse en el período agudo de la enfermedad, antes de iniciar el tratamiento con antimicrobianos. Se recoge una muestra de una evacuación espontánea reciente, en frasco estéril. En caso de no poderse obtener la muestra, se realiza una hisopado rectal. Para los estudios epidemiológicos de portación fecal, las muestras de heces son más productivas que los hisopados rectales.
Transporte y recepción
• Remitir al laboratorio refrigerada en forma urgente y alertar que la muestra está en tránsito
• Rotular muestra con información demográfica, fecha, hora y sitio de recolección (punción lumbar, derivación ventricular)
• Procesar la muestra en forma inmediata
• La muestra debe ser procesada inmediatamente se puede mantener a 4 ºC por 48 horas.
• Para muestras que requieran mayor tiempo de almacenamiento, congelar a –20 ºC y enviar al laboratorio acondicionada con hielo seco
Fuente: Servicio Bacteriología Especial Departamento de Bacteriología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán” (2008). Manual de Procedimientos Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria monocytogenes. Buenos Aires: Callejo, R. , Prieto, M. , Martínez, C. , Aguerre, L. , Rocca, F. y Martínez G.
listeria monocytogenes, materia fecal
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Aislamiento e identificación
Materiales. Equipamiento
• Ansa
• Cabina de bioseguridad
• Incinerador de ansas
• Estufa de cultivo 35 – 37 ºC
• Microscopio con lente de inmersión 100X de magnificación
• Portaobjeto de vidrio
Consideraciones de bioseguridad
• Consideraciones generales para patógenos clase II.
• Utilizar cabina de bioseguridad para prácticas microbiológicas con potencial formación de aerosoles.
• Utilizar siempre guantes
• La presencia de mujeres embarazadas e individuos potencialmente inmunodeprimidos debe estar
absolutamente prohibida en áreas donde se manipule Listeria monocytogenes
Reactivos y Medios de cultivo
• Aceite de inmersión
• Agar tripteína soya
• Agar tripteína soya con 5% sangre ovina
• Caldo Fraser
• Caldo nutritivo
• Medios selectivos (agar Oxford modificado MOX)
• Equipo para coloración de Gram
• Peróxido de hidrógeno al 3%
Procedimiento
| Día 1 | Comentarios |
| • Colocar 1 g o 1 ml de materia fecal en 10 ml de caldo UVM • Incubar 24 horas a 30 ºC |
|
| Día 2 | Comentarios |
| • Sembrar 0.1 ml de UVM en medio selectivo agar MOX • Sembrar 0.1 ml de UVM en 10 ml de caldo Fraser • Incubar a 30 ºC por 24 horas |
|
| Día 3 | Comentarios |
| • Observar presencia de colonias sospechosas en el agar Oxford y subcultivar hasta 5 colonias en medio sólido (agar sangre, agar tripticasa soya), y medio líquido (caldo nutritivo). Incubar medios sólidos a 35 ºC por 18-24 horas y medio líquido a 22 ºC • Sembrar 0.1 ml de caldo Fraser en agar MOX e incubar a 30ºC por 24 horas |
A las 24 horas las colonias típicas de L. monocytogenes en agar MOX, son pequeñas, rodeadas de halo de ennegrecimiento debido a la hidrólisis de esculina |
| Día 4 | Comentarios |
| • Observar beta hemólisis, realizar prueba de catalasa coloración de gram y observar movilidad en fresco • Si el desarrollo de colonias sospechosas en agar selectivo es negativo a las 24 horas, observar nuevamente y en el caso de aparición de colonias proseguir como descripto en día 3 |
La observación de bacilos o cocobacilos gram positivos, móviles, beta hemolíticos, catalasa positiva, indica sospecha de Listeria monocytogenes. Confirmar identificación con pruebas |
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Microscopía de la muestra
Materiales. Equipamiento
- Ansa
- Cabina de bioseguridad
- Incinerador de ansas
- Microscopio con lente de inmersión 100X de magnificación
- Portaobjeto de vidrio
Nota: el uso de cabina de bioseguridad evitará la contaminación del cultivo o muestra, así como protegerá al operador
Reactivos
- Aceite de inmersión
- Equipo de colorantes para Gram
Procedimiento
| Día 1 | Comentarios |
| • Colocar 5 a 6 gotas de la muestra en un portaobjeto y extender • Dejar secar dentro de la cabina de bioseguridad • Colorear con la técnica de Gram, observar e interpretar • La observación de cualquier número de cocobacilos Gram positivos debe ser informado inmediatamente al médico tratante |
El número de L. monocytogenes en el LCR puede ser menor a 103 UFC/ml, por lo tanto la concentración por centrifugación para la coloración de Gram es importante para el diagnóstico rápido |
Aislamiento e identificación
Materiales. Equipamiento
- Ansa
- Cabina de bioseguridad
- Incinerador de ansas
- Estufa de cultivo 35 – 37 ºC con atmósfera de 5% de CO2
Medios de cultivo
- Agar tripteína soya
- Agar tripteína soya con 5% sangre ovina
- Caldo nutritivo
Procedimiento
| Día 1 | Comentarios |
| • Centrifugar la muestra para concentrar • Aspirar el fluido desde el fondo del tubo utilizando una pipeta estéril y colocar 2 ó 3 gotas en una placa de agar tripticasa soja con sangre ovina al 5% y en una placa de agar tripticasa soya sin sangre. Sembrar en técnica de aislamiento en cuatro cuadrantes • Inocular también en caldo tioglicolato o caldo nutritivo. Incubar placas a 35 - 37 ºC en atmósfera de 5% de CO2 por 24 - 48 horas. Incubar caldos a 35 – 37 ºC en atmósfera normal |
El número de L. monocytogenes en el LCR puede ser menor a 103 UFC/ml, por lo tanto la concentración por centrifugación mejora la recuperación por cultivo |
| Día 2 | Comentarios |
| • Examinar las placas y caldos a las 24 horas para detectar evidencia macroscópica de desarrollo bacteriano. En caso negativo, reincubar • Realizar coloración de Gram y prueba de catalasa de colonias sospechosas en placa de agar tripteína soya • Subcultivar en estría de agar tripteína soya |
Colonias sospechosas: pequeñas convexas, transparentes-grisáceas con beta hemólisis difusa La observación microscópica de bacilos pequeños o cocobacilos gram positivos, la presencia de colonias pequeñas con beta hemólisis difusa y catalasa positiva representa una fuerte sospecha de L. monocytogenes que debería ser informada al médico tratante en forma inmediata |
| Día 3 | Comentarios |
| • A partir del subcultivo en estría proseguir la identificación confirmatoria | En caso de microscópica positiva a partir del Gram directo de la muestra con cultivos negativos a las 24 horas, reincubar las placas y caldos por al menos una semana y observar diariamente |
Fuente: Servicio Bacteriología Especial Departamento de Bacteriología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán” (2008). Manual de Procedimientos Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria monocytogenes. Buenos Aires: Callejo, R. , Prieto, M. , Martínez, C. , Aguerre, L. , Rocca, F. y Martínez G.
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